جداسازی و کلونینگ cdnaی ژن تولید کننده ی انسولین انسانی igf-1

با توجه به مزایای زیاد گیاهان برای تولید پروتئین های نوترکیب، توسعه ی روش های مناسب برای تولید پروتئین های مهم در سلامت و درمان بیماری های انسانی بسیار مورد توجه قرار گرفته است. در ایران نیز با توجه به اینکه تعداد زیادی از این پروتئین های نوترکیب از خارج تامین می شود، ایجاد سیستم های مناسب برای تهیه ی این نوع پروتئین ها در داخل کشور ضروری به نظر می رسد. یکی از پروتئین های مهم انسانی، igf-1 می باشد که نقش اساسی در درمان بیماری هایی از قبیل دیابت، پوکی استخوان، چاقی، اختلالات عصبی و عضلانی و ...، ایفا می کند. بنابراین، در این پژوهش تلاش گردید تا زمینه لازم برای تولید این پروتئین در گیاهان و به ویژه در ارگانل های کلروپلاست فراهم گردد. برای این منظور، ابتدا rnaهای کل از سلول های کشت شده ی انسانی استخراج شده و از روی آن cdna تهیه گردید. سپس قطعه cdnaی مربوط به ژن igf-1 با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی تکثیر و در وکتور pgbkt7 کلون گردید. پس از تعیین توالی قطعات کلون شده و تطبیق آنها با توالی ثبت شده، یکی از توالی های کاملا منطبق برای ادامه ی کار در وکتور پایه ی pmcs5 کلون گردید. با توجه به مزایای بسیار زیادی که انتقال ژن به کلروپلاست نسبت به انتقال ژن به هسته دارد، ژن کلون شده در دو مرحله در وکتورهای اختصاصی انتقال ژن به کلروپلاست توتون کلون گردید. برای این منظور ابتدا ژن igf-1 با استفاده از سایت های برشی ndei و xbai در وکتور phk20 و در بین یک پروموتر و ترمیناتور کلروپلاستی که از قبل در وکتور جاسازی شده بودند، کلون گردید. در نهایت ژن کلون شده به همراه پروموتر و ترمیناتور و با استفاده از سایت های برشی saci و hindiii در وکتور کلروپلاستی prb94 که حامل ژن انتخابگر aada برای گزینش گیاهان تراریخته می باشد، کلون گردید. با توجه به تشابه بسیار زیاد توالی ژنوم کلروپلاستی توتون و کاهو، و با توجه به نتایج حاصل از مطالعه ی قبلی، می توان پیش بینی کرد که این وکتور برای انتقال و تولید این پروتئین در کلروپلاست گیاه خوراکی کاهو (جهت تولید پروتئین خوراکی بدون نیاز به مراحل استخراج و خالص سازی و تجویز مستقیم بافت گیاهی به عنوان دارو)، امکان پذیر خواهد بود.